Dr. rer. nat. Kerstin Seyfarth

Ausbildung

2008-2013

Promotion zum Doktor der Naturwissenschaften

 

Institut für Mikrobiologie und Weinforschung der Johannes Gutenberg Universität Mainz

Zusammenfassung

Der Dissertation mit dem Thema:

Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure

In NawaRo-Biogasanlagen (BGA) kann es durch das Angebot an leicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen zu einer bakteriell bedingten Übersäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren kommen. Häufiger kommt es zur Akkumulation von Propionsäure. Methanogene Archaea können bei niedrigen pH-Werten nicht mehr wachsen. Somit kann der gesamte Prozess der mikrobiellen Bildung von Biogas zum Erliegen kommen, was für die Biogasbetreiber zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Das Ziel dieser Dissertation war die Aufklärung der anaeroben bakteriellen Population, die in Biogasanlagen Propionsäure abbauen kann. Aus Propionat entsteht dabei Acetat und Wasserstoff. Da dieser anaerobe Prozess endergon verläuft, kann Propionsäure anaerob nur abgebaut werden, wenn der Wasserstoffpartialdruck niedrig gehalten wird. Diese Aufgabe erfüllen in Biogasanalgen methanogene Archaea. Die sog. sekundären Gärer leben somit in synthropher Kultur mit methanogenen Archaea.

In dieser Arbeit wurden die Mikroorganismen von Propionsäure-abbauenden Anreicherungskulturen aus vier NawaRo-BGA‘s identifiziert und ihr Substrat- und Produktspektrum analysiert. Die Anreicherungskulturen wurden vom Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen der erhaltenen stabilen Propionsäure-abbauenden Mischkulturen wurde gezeigt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Verwandte von den Clostridiales, aber auch Bacteroides sp., δ-, ε- sowie γ-Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise auch Thermotogales befanden. Aus Propionsäure-abbauenden Mischkulturen und aus Fermentern mesophiler NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea angereichert und isoliert. Es wurden aus den Propionsäure-abbauenden Mischkulturen Stämme in Reinkultur erhalten, die entsprechend der 16S rDNA-Analyse als Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 identifiziert wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-BGA‘s als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik in Potsdam-Bornim e.V. (ATB) wurden Reinkulturen von methanogenen Archaea erhalten. Diese konnten den Species Methanobacterium formicicum, Methanoculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. zugeordnet werden. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem die typischen bisher nur durch molekularbiologische Methoden identifizierten Species methanogener Archaea aus unterschiedlichen Fermentern in Reinkultur erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der kultivierten methanogenen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert. Es zeigte sich, dass die hydrogenotrophe Methanogenese der effizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Mit der Bestimmung der Zellzahl des Isolates Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanbildung wurde gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Neben Pflanzenfasern beinhalteten das hergestellte Reaktorfiltrat in den Kultivierungsansätzen Acetat, die essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol. Gezielte Mischkulturen von sekundären Gärern mit methanogenen Isolaten ergaben einen fördernden Einfluss auf diese Bakterien durch hydrogenotrophe Archaea. Diese Bakterien bauten Substrate ab oder bildeten Produkte, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzen konnten.

2000-2006

Diplomstudium zur Diplom-Biologin

 

Technische Universität Darmstadt

 

Diplomprüfungsfächer: Mikrobiologie, Biochemie, Entwicklungsbiologie

Zusammenfassung

Der Diplomarbeit mit dem Thema:

Gerichtete Mutagenese zur Funktionsbestimmung einzelner Aminosäuren aus der Schwefel Oxygenase- Reduktase

Im chemolithotrophen Crenarchaeon Acidianus ambivalens stellt die Schwefel-Oxygenase /-Reduktase das initiale Enzym im aeroben Energiestoffwechsel dar. Das Enzym katalysiert die Bildung von Sulfit, Thiosulfat und Schwefelwasserstoff aus elementarem Schwefel. Es enthält ein mononukleares nicht-häm Eisenzentrum. Röntgenstrukturanalyse, Proteinsequenzvergleich und Funktionsanalysen der SOR identifizierten drei nahe des Eisenzentrums in die Bindetasche ragende Cysteine und ein konserviertes H-X3-H-X23-E Motiv, in dem zwei Histidine H86 und H90 und Glutamat E114 (zweizähniger Ligand) als Eisenliganden dienen. Das Eisen erfährt insgesamt eine sechsfache Koordination im reaktiven Zentrum, da es zusätzlich von zwei in der Bindetasche organisierten Wassermolekülen koordiniert wird. Diese sind ebenfalls konserviert. Ein drittes Wasser ist in der Bindetasche organisiert, welches wohlmöglich zur das Substrataktivierung nötige Nucleophil darstellen könnte. Das aus 24 Untereinheiten bestehende Holoenzym zeigt an seiner vierfach-Symmetrieachse sechs schornsteinartiger Ausstülpungen die eine, von den zwei konservierten Aminosäuren F133 und F141 zum Teil verschlossene Pore bilden. Vermutlich fungieren diese Strukturen als Ein- und Ausgangskontrollpunkte für Substrat und Produkte.

In dieser Diplomarbeit wurden durch ortsspezifische Mutagenese einige der in die Bindetasche der SOR ragenden Aminosäuren gezielt ausgetauscht: N9, Q76, T78, W80 und E87. Zusätzlich wurden Aminosäuremodifkationen im Bereich der schornsteinartigen Ausstülpungen vorgenommen: F133, F141, Doppelmutante F133/141A, sowie Deletionen des halben und des ganzen "Schornsteins". Die Expression der so mutierten Gene erfolgte in E. coliBL21CodonPlus. Für Aktivitätsmessungen und eine Eisengehaltsbestimmung wurden ausreichende Mengen Protein durch Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt (Ausbeute: 0,11 mg bis 6,18 mg). Mutationen von N9 hatten geringe Wirkung auf die Aktivität. Mutante Q76A zeigte eine auf 15 % verringerte die Aktivität mit vollständigem Verlust der Reduktaseaktivität. Die Aktivität von Q76N sank auf 19 %. Vollständigen Verlust der Aktivität hatte Mutante T78A und bei T78S verringerte sich diese auf 36 %. W80A hatte eine Aktivität von 20 % mit vollständigem Verlust der Reduktaseaktivität, und W80F erbrachte 21 %. E87A zeigte keine Aktivität, wogegen E87D eine Steigerung der Aktivität auf das 3-fache erbrachte. Aus den Ergebnissen wurde abgeleitet, dass die Aminosäuren N9, Q76, T78 und W80 wahrscheinlich an der Stabilsierung der polaren Oberfläche in der Bindetasche durch Wasserstoffbrücken untereinander oder zum dritten geordneten Wasser beteiligt sind, wogegen E87 an der sekundären Eisenkoordination beteiligt ist. Bei den Mutanten an der Peripherie der SOR stellte sich heraus, dass je größer die Erweiterung der „Schornsteine“ war, desto höher stieg die Aktivität der SOR, was eine Steigerung bis auf das 15-fache der Aktivität des Wildtyps führte. Dabei veränderte sich die Stöchiometrie zwischen Oxygenase- zur Reduktaseaktivität, was zuvor noch nicht beobachtet worden war: Je höher die Aktivität, desto stärker die Verschiebung zu Gunsten der Reduktaseaktivität.

2000

Allgemeine Hochschulreife

 

Leibnizschule, Gymnasium der Stadt Offenbach

 

Leistungsfächer: Biologie und Chemie

 


Zeugnisse gerne auf Anfrage

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